無菌動物無菌檢測方法的利弊及影響因素

　　摘    要：　近年來，腸道微生物在人類的健康和疾病中的應用受到了廣泛關注。無菌動物在腸道微生態中的模型應用越來越廣泛，為人類的生理、病理研究提供了非常有效的研究工具。為保證實驗動物的質量，必須對無菌動物頻繁的進行無菌檢測。但無菌檢測受到諸多因素的干擾。目前傳統的檢測方法主要是細菌、真菌培養及革蘭染色鏡檢。隨著高通量測序的發展，現在新增了一種分子生物學檢測技術（PCR），利用16S rRNA進行細菌的鑒定。但這些方法都存在一定的局限性。本文將對這些方法的利弊及影響因素進行簡要探討。

　　關鍵詞：　無菌動物; 無菌檢測; 細菌培養; 16S rRNA; PCR;

　　Abstract：　In recent years, the role of intestinal microorganisms in human health and diseases has been widely researched. The application of a germ-free animal model in intestinal microecology is extensive and this model provides a very effective research tool for human physiological and pathological research. To ensure the quality of experimental animals, aseptic tests must be frequently performed. However, sterility tests are affected by many factors. At present, the traditional detection methods are mainly bacterial and fungal culture and Gram staining. With the development of high-throughput sequencing, polymerase chain reaction methods have been used to identify bacteria using 16S rRNA. However, these methods have some limitations. In this paper, we discuss the advantages and disadvantages of these methods and the influencing factors.

　　Keyword：　Germ-free animal; aseptic test; bacterial culture; 16S rRNA; PCR;

　　無菌動物（germ-free，GF）是指身體任何部位及生活環境中均檢測不出任何活的細菌、真菌、病毒及寄生蟲的動物[1]。無菌動物來源于剖腹產和胚胎移植，通過人工飼養，維護在正壓無菌隔離器中的動物[2]。所有的飼料、墊料及水均經滅菌處理，檢測無菌后方可傳入無菌隔離器內。維持無菌動物需要嚴格的無菌操作技術和定期的無菌檢測。由于不攜帶任何可檢測的微生物，可排除背景微生物對實驗結果的干擾，獲得高重復性，高敏感度的實驗結果。這種動物可以有選擇性的接種多菌和單菌，來研究菌種對宿主的作用[3]。無菌動物不是絕對無菌，而是相對無菌。在現有的無菌檢測技術下檢測不到任何微生物[4]。
 

　　1928年到1980年，Reyniers等[5,6]與Knight等[7]證實了哺乳動物、鳥、魚、昆蟲等可在無菌條件下飼養和維持。也是他們建立了第一代無菌大鼠和無菌小鼠。1945年美國圣母大學Lobund實驗室的Reyniers等[5]首次培育出能連續傳代的無菌大鼠，接著Gustafsson[8]也成功培育無菌大鼠。Gilbert等[9]通過去除動物中不同微生物的方法來研究其與宿主的關系。Kirk等[10]對微生物與宿主的關系做了詳細的闡述。

　　微生物的質量控制成為無菌動物培育中至關重要的技術。從過去到現在，細菌、真菌的培養和革蘭染色鏡檢仍然是最常用的方法[11,12,13]。但在人工培養基上，由于條件限制，有些微生物不能生長，這就導致了無菌檢測結果的不準確。為此有些實驗室增加了分子生物學檢測技術PCR，利用16S rRNA進行細菌的鑒定，用以彌補上述兩種檢測方法中的不足[13]。本文將結合國內外相關文獻，對無菌動物無菌檢測方法及影響因素進行簡要探討。

　　1、 微生物培養

　　1.1 、采樣

　　1.1.1、 糞便標本的采集

　　選取無菌隔離器內健康成年無菌大鼠，抓取尾巴，讓糞便自然排出，棄去第一粒糞便。收取第二粒新鮮糞便裝于無菌小試管中。按照無菌操作程序從隔離器中傳出，并盡快接種完畢，防止在轉運過程中細菌死亡。

　　1.1.2 、隔離器內環境標本的采集

　　將無菌隔離器內滅菌棉簽用無菌水浸濕，擦拭水瓶口、進出通風口、隔離器內壁、籠具表面、動物毛發、手套等。裝于無菌小試管中，按照無菌操作程序從隔離器中傳出。棉簽必須使用高壓蒸汽滅菌，干熱滅菌會使脫脂棉產生殺菌物質，影響細菌的檢出。

　　1.1.3、 飼料、墊料及水標本的采集

　　將無菌隔離器內飼料、墊料、水均取適量裝于無菌小試管中，按照無菌操作程序從隔離器中傳出

　　1.2 、細菌、真菌培養

　　1.2.1、 國內無菌動物檢測標準

　　污染無菌動物的微生物主要是厭氧菌、需氧菌及真菌，可以通過不同的培養基、不同的培養溫度和培養環境對污染菌進行檢測。目前我國無菌動物的檢測標準主要根據GB/T 14926.41-2001《實驗動物 無菌動物生活環境及糞便標本的檢測方法》，該標準中規定無菌檢測中所使用的培養基及試劑、檢測程序、操作步驟及結果報告等。3種液體培養基為腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、硫乙醇酸鈉肉湯（thioglycollate broth，TB）、大豆蛋白胨肉湯（tryptic soy broth，TSB），1種固體培養基血瓊脂平板，試劑為無菌生理鹽水。標本采集后，接種腦心浸液肉湯和硫乙醇酸鈉肉湯、大豆蛋白胨肉湯增菌培養，放37℃培養，分別以7、14 d轉接血平板并革蘭染色鏡檢。轉接血平板后37℃培養48 h，觀察有無細菌、真菌生長，最終判斷是否存在細菌、真菌污染。此標準刪除了GB/T 14926.41-1994《無特定病原體動物無菌動物生活環境及糞便標本的檢測方法》中的無特定病原體動物生活環境及糞便標本的檢測方法，保留了無菌動物生活環境及糞便標本的檢測方法。增加了硫乙醇酸鈉培養基在使用前需煮沸驅氧程序。再從液體培養基轉種血瓊脂平皿時增加了涂片染色鏡檢。以防止在轉種時細菌死亡而不能在平板培養基生長而造成漏檢。GB/T14926.43-2001《實驗動物 細菌學檢測、染色法、培養基和試劑》，該標準對培養基的配制、分裝、高壓滅菌條件、儲藏條件及使用期限作了規定。

　　1.2.2、 國內無菌動物檢測的優缺點

　　國內標準對標本采集數量、標本稀釋程度、標本存放及接種時間都未做詳細規定。檢測時未對需氧、厭氧培養進行區分。對培養基的接種管數及陽性對照菌未詳細規定。冷藏后培養基需怎樣處理后使用未做詳細規定。微生物培養方法被認為是有一定局限性的，三種培養基不能培養所有微生物。好多哺乳動物的腸道微生物在實驗室里不容易培養，主要缺乏合適的培養基和方法。培養鑒定微生物污染技術較繁瑣和困難。嚴格的厭氧菌培養需要特殊的設備和專業的操作。

　　腦心浸液肉湯適合細菌的增菌培養，大部分需氧菌、兼性厭氧菌都能生長，如糞性鏈球菌、大腸埃希菌及苛養菌的培養。硫乙醇酸鈉肉湯適合需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌的培養，主要用于厭氧菌的培養。硫乙醇酸鹽流體培養基在2000年、2005年及2015年版中國藥典中被用作無菌檢查培養基，歐洲藥典（EP）、日本藥典（JP）、英國藥典（BP）、美國藥典（USP）無菌檢查也均采用硫乙醇酸鹽流體培養基，配方一致，用于需氣菌、兼性厭氧菌、厭氣菌的培養。雖然硫乙醇酸鹽流體培養基被各國用作無菌檢查，但它自身也存在一定的局限性[14]：（1）一些苛養菌或強致病菌較難檢出；（2）刃天青對微生物有抑制作用、與專門的厭氧菌培養方法如厭氧缸法、厭氧袋（bio-bag）、厭氧手套箱（anaerobieglovebox）、厭氧盒等相比較，其厭氧環境有限。

　　革蘭染色鏡檢也存在各種干擾因素，如飲食中的蔬菜纖維、糞便中的各種物質、食物中留下的死菌。無法鑒別是死菌或活菌，需要培養方法來確認[15]。革蘭染色陽性細菌相對容易檢出和觀察，而體積較小的革蘭陰性球菌則較難觀察到。革蘭染色鏡檢的檢出限量約109 CFU/g糞便[16]。對于無菌動物來說，污染初期腸道中微生物是比較少的，易受到糞便中的殘渣、碎屑等因素的干擾。對于有經驗的觀察者來說也是非常極具挑戰性的，極易造成漏檢。總之，革蘭染色鏡檢的確定是對檢測靈敏度較低、易造成漏檢，優點時即時出結果、速度較快、操作簡便、成本較低。

　　1.2.3 、中國藥典（2015版）無菌檢查

　　相較于國內動物無菌檢測，中國藥典無菌檢測方法相對比較全面，但僅適用醫藥用品。目前，美國、歐盟、日本等國家或組織無菌檢查法已協調一致[17]。相比于2010版中國藥典，2015版中國藥典對無菌檢測法的的檢測范圍及環境要求、培養體系、方法適用性、檢查方法等做了進一步完善，接近國際通用標準。2015版中國藥典中規定了無菌檢查必須在無菌環境下進行，實驗環境必須達到無菌的要求。培養基主要使用硫乙醇酸鹽液體培養基和胰酪大豆胨液體培養基。硫乙醇酸鹽液體培養基主要用于厭氧菌的培養；胰酪大豆胨液體培養基主要用于需氧菌和真菌的培養。這與國內無菌動物檢測采用的培養基相同。胰酪大豆胨液體培養基的PH =（7.3 ± 0.2），接近中性，適用于需氧菌和真菌的培養[18,19,20]。藥典規定了培養基PH測定的溫度應在25℃。細菌培養的溫度在20 ~ 25℃和30 ~ 35℃，符合了大部分微生物的需求。規定了微生物的培養時間[21]。規定了培養基的接種管數，對陽性對照菌的選擇做了細化。

　　1.2.4 、國外無菌動物無菌檢測

　　國外無菌檢測所使用的培養基各不相同，培養時間和方法也不統一。國外無菌小鼠無菌檢測使用培養基有LB培養基（LB）、沙保培養基、腦心浸液（brain heart infusion broth，BHI）、MRS瓊脂培養基、ML瓊脂培養基[22]。取1 mL標本懸液接種在BHI、MRS、ML、LB培養基37℃培養72 h，沙保培養基22℃培養3周。標本懸液直接涂片鏡檢。

　　也有報道使用腦心浸液肉湯（需氧菌培養）、硫乙醇酸鈉肉湯（厭氧菌培養）、沙保肉湯（真菌培養），37℃培養1周甚至更長，以防生長緩慢的細菌漏檢。血平板和其它非選擇性培養基37℃至少培養5 d。推薦接種一份標本于稍低溫度培養，比如30℃或室溫，更適合環境微生物的生長[15]；也有研究推薦增加56℃培養[23]。液體培養基出現渾濁再接種固體培養基培養和顯微鏡鏡檢。渾濁可能接種后幾天出現，但不一定是細菌生長，有可能是糞便和其它有機物沉淀。此法與國內無菌動物檢測標準所使用培養基基本一致。

　　有研究使用腦心浸液肉湯、沙保肉湯以及營養肉湯作為無菌檢測培養基[11]，需氧和厭氧兩種環境37℃培養48 h。兩種環境下培養設置陰性對照和陽性對照。最好使用厭氧菌來確定無氧環境。

　　國外無菌檢測的內容和方法包括：（1）直接涂片鏡檢法：當無菌動物腸道中有大量細菌繁殖時，可以利用相差顯微鏡快速的檢測腸道中的細菌，但因為此法細菌未經染色，會對有些比較小和不運動的細菌造成漏檢，需要非常有經驗的操作者，對食物殘渣和細菌進行辨別。（2）細菌染色鏡檢：包括革蘭染色鏡檢、DNA染色法。（3）細菌、真菌培養。（4）分子生物學檢測。（5）病毒學檢測。（6）寄生蟲學檢測[15]。

　　1.2.5 、無菌檢測培養方法的局限性

　　傳統的細菌檢測方法，容易培養的是需氧和兼性厭氧菌，只占腸道細菌總量的小部分。比如乳酸桿菌、鏈球菌、腸球菌和葡萄球菌等。但是嚴格厭氧菌在腸道細菌中所占的比例極高，每克糞便中含1011個嚴格厭氧菌。通過培養容易檢測的嚴格厭氧菌的比例約每克糞便106個，甚至更低[15]。

　　雖然微生物培養是比較敏感的方法，但它有一定的檢出限量，當腸道細菌數量少于100 ~ 1000 CFU/g糞便[24]。不容易檢出。它的污染因素也有很多，比如實驗室里常用的細菌的污染；實驗室工作人員的皮膚和普通動物糞便的污染；飼料、墊料、器械等高壓滅菌不徹底而傳進隔離器造成的污染。實驗室里細菌的污染通常都是人工培養基上能較好生長的細菌。皮膚上的葡萄球菌和糞便中的大腸桿菌都能在人工培養基上較好生長。微生物培養必須經過嚴格無菌操作培訓的專業人員進行操作，必須在超凈臺或者生物安全柜中進行，否則出現假陽性的概率還是挺高的。培養的標本量的多少也會影響結果。因此，培養出現陽性結果必須借助其他方法證實其結果的可靠性。

　　2 、分子生物學技術

　　2.1、 采樣

　　在無菌正壓隔離器中，取新鮮無菌動物糞便和飼料，稱量約200 mg于1.5 mL無菌離心管中。按照無菌操作傳出隔離器，立即液氮冷凍并轉移至-80℃冰箱保存，直到DNA提取。

　　2.2、 16S rRNA基因測序應用于無菌動物無菌檢測

　　目前16S rRNA基因測序是鑒定腸道細菌常用的分子生物學技術。利用16S rRNA分析腸道微生物群至少包括1800個種屬和40 000種細菌[25]。提取哺乳動物新鮮糞便中的DNA，通過細菌通用引物進行PCR擴增，再經16S rRNA基因測序，得到細菌的種類。一般細菌鑒定選擇細菌通用引物，最常用的引物是27F/1492R。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。有的文章中會使用不同的通用引物[26]。有文獻提到利用16S rRNA PCR技術證明無菌動物的無菌狀態[11]。RAPD PCR用于鑒定已知定植菌動物的污染[15]。國外對PCR、qPCR等分子生物學技術在無菌動物和已知菌動物做了詳細的比較，結果16S rRNA PCR最適用于無菌動物的檢測[13]。

　　2.3、 16S rRNA在無菌動物無菌檢測中的優點

　　過去十幾年，分子生物學技術在腸道微生物中的應用超過了細菌培養方法。16S rRNA技術因具有快速、高效的特點。相對于細菌培養技術，PCR技術特異性較高，被用于細菌的種屬鑒定。16S rRNA能夠鑒定難以分類的微生物種類，特別是需要嚴格厭氧的細菌，鑒定培養陰性的細菌。現在人們開始使用16S rRNA技術檢測無菌動物是否污染，可以增加檢測的敏感性和最大限度的檢出生長不良或較難檢出的細菌污染[27,28,29]。相比較其它細菌測序方法，16S rRNA價格較便宜。分析時不需要太多的計算量。樣本數量越大，統計數據越準確[30]。

　　2.4 、16S rRNA在無菌動物無菌檢測中的缺點

　　16S rRNA技術相對于細菌培養，敏感性較低，16S rRNA對細菌的檢出限量約105 CFU/g糞便[16]。這與16S rRNA技術是個非常敏感的檢測手段相矛盾。低于這個數量，就很難檢測出來。當無菌動物糞便中的含菌量低于這個數量，就很容易造成漏檢。但檢測污染嚴重的無菌動物還是非常有效的。糞便樣本DNA的提取結果和PCR引物的選擇，對16S rRNA鑒定的結果影響較大。16S rRNA只能對細菌種屬鑒定，不能進行細菌定量。無法辨別糞便中是死菌或活菌[30]。相對于細菌培養和革蘭染色鏡檢，16S rRNA測序花費時間較長，而且檢測時間較長。

　　雖然存在于腸道中的大部分微生物是細菌，但仍有部分真菌和古菌的存在[31]。利用16S rRNA基因測序只能檢測腸道中的細菌種類。大量不同形態的真菌存在哺乳動物的腸道中[32]。124個健康歐洲人的糞便標本，利用宏基因組測序536 112個獨立基因，其中0.8%是古菌[33]。16S rRNA只是鑒定細菌的污染。有方法提到利用專門的DNA提取技術和qPCR來鑒定真菌[34]，古菌的擴增引物也有被描述[35]。

　　2.5 、16S rRNA在無菌動物無菌檢測中的影響因素

　　16S rRNA在無菌動物無菌檢測中，需防止樣本采樣中、分析中的污染。在無菌隔離器中采樣并稱重，保持樣本無菌包裝并密封。新鮮無菌動物糞便從無菌隔離器中傳出后，應盡快進行PCR分析，以盡量減少樣本和分析中的污染風險[11]。所有操作必須在超凈臺中進行，每一步都必須無菌操作，且操作人員必須通過專業培訓。檢測糞便樣本中含有較多的植物，聚合酶抑制劑可能會影響PCR分析。這些因素可以通過設計用于糞便樣本中提取DNA的試劑盒來減少[15]。食物中存在細菌的DNA應該被考慮在內，低含量的DNA通常在腸道中被檢測到，除非使用化學定義飲食[15]。輻照飼料中的葉綠素也會干擾DNA的提取，不能確定是細菌DNA還是植物DNA，從而影響PCR分析。需通過16S rRNA測序進一步來鑒定是否是細菌DNA。如是細菌DNA，需進行細菌培養和革蘭染色確定是否為活菌[30]。DNA的提取質量至關重要，直接影響16S rRNA測序的結果[30]。檢測樣本中含菌量的多少將會直接影響無菌檢測結果，16S rRNA測序具有一定的檢出限量，需借助其它檢測方法進一步檢測[16]。

　　3 、食物經過不同的滅菌方法對無菌檢測的影響

　　現在無菌動物飼料的滅菌方法主要有兩種：高壓蒸汽滅菌與鈷60輻照滅菌。滅菌飼料中的死菌會不會經過腸道存在動物糞便中。（1）當無菌動物飼喂輻照滅菌飼料，糞便微生物培養檢測陰性。革蘭染色鏡檢確存在典型的革蘭陽性桿菌[15,36]。繼續喂食同一批飼料，到第4天細菌數量開始下降，直至第8天細菌完全消失。重新引入新一批輻照飼料飼喂無菌動物，細菌重新出現，并于第10天消失。細菌數量未增加，證實不存在活菌。經過一段時間，死菌在腸道中會被分解消化[37]。（2）飼喂高壓滅菌飼料，糞便微生物檢測陰性。革蘭染色鏡檢也會觀察到少量死菌，但已經失去典型的形態學特征[16]。

　　關于高壓滅菌飼料和輻照滅菌飼料利用PCR技術是否能檢測到細菌DNA，大部分僅介紹了PCR檢測結果，描述了滅菌過的飼料未檢測到細菌DNA，但對哪種滅菌方法未做詳細介紹[13]。我們對兩種飼料作了比較，高壓滅菌飼料經PCR擴增不出細菌DNA。輻照滅菌的飼料由于含有葉綠體，PCR擴增后，跑膠會出現明顯條帶，通過16S rRNA測序證明會有極少數細菌DNA未被完全破壞，可有少數死菌DNA會被擴增出來，造成假陽性。飼喂兩種飼料，利用16S rRNA PCR技術，無菌動物糞便中均未擴增出細菌DNA。這與報道的輻照飼料的細菌結構未被破壞，有可能存在無菌動物糞便中相吻合[15]。

　　4、 無菌動物的檢測頻率

　　國外對無菌動物無菌檢測頻率未做規定，按照國外最近發行文章的無菌動物檢測頻率要求：（1）空隔離器（動物傳遞之前），濕棉拭子取隔離器表面，角落，通風口標本做1次無菌培養及PCR檢測；（2）對無菌隔離器內飼料、墊料標本每4周做1次無菌培養。（3）無菌動物糞便標本每4周做1次無菌培養及PCR檢測。（4）3 ~ 6個月做1次動物全身檢測，包括無菌培養，病毒檢測、寄生蟲檢測及PCR檢測。（5）水、飼料、墊料每批滅菌均需滅菌指示劑合格，傳遞之前均需做無菌培養[15]。

　　一些機構報道無菌檢測需2周1次或者每周1次，PCR檢測每月1次[11]。檢測方法包括宏觀和微觀鏡檢、細菌和真菌培養和分子生物學方法[15]。美國charles river實驗室對飼養的無菌小鼠檢測頻率，每周對每個隔離器飼料、墊料、糞便做1次細菌真菌培養和相差顯微鏡觀察有無活的微生物。每季度取一次無菌小鼠糞便，做16S rRNA PCR檢測。每年做1次動物組織和器官病原體檢測、血清學檢測、寄生蟲檢測等項目。

　　5、 結語

　　綜上所述，在無菌動物的無菌檢測中，不管是培養方法、革蘭染色鏡檢及16S rRNA PCR。都有固有的缺陷和優點。只有三種方法互相結合，取長補短。把無菌動物的無菌檢測漏檢率降到最低，才能有效的確保無菌動物的無菌狀態。

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