淺析海洋環境監測中應用分子生物學技術的作用

　　摘要：我國海域面積遼闊,為保護海洋環境,維持海洋經濟可持續發展,必須提高海洋環境監測能力。迅速發展的分子生物學技術作為一種有力手段能運用于海洋環境監測。論文概述了多種分子生物學技術方法(PCR、克隆文庫、變形梯度凝膠電泳、環介導等溫擴增、實時定量PCR、限制性片段長度多態性、核酸探針和基因芯片等)在鑒定海洋生物、評價海洋微生物安全、發現生物入侵種和評估海洋污染物的生態效應等方面的運用。期望為全面了解分子生物學技術并為海洋環境監測的合理應用提供理論借鑒。

　　關鍵詞：分子生物學技術; 海洋環境; 環境監測; 基因;

　　1 前言

　　我國是一個海洋大國,有著1.8萬多公里的大陸海岸線和1.4萬多公里的島嶼岸線,擁有6500多個島嶼和約300萬平方公里的管轄海域面積。海洋面積大約占到我國陸地國土面積的1/3。海洋是新的生存和發展空間,是生物資源、能源、水資源、金屬資源的戰略性開發基地,對世界經濟的貢獻率已經達到4%以上[1]。然而,隨著沿海地區人口的增多、海洋經濟的迅速發展和海洋開發利用程度的加強,導致大量工農業廢水、養殖廢水和生活污水排入海洋使得海洋近岸富營養化程度和有毒有害物質污染日趨嚴重,導致病原微生物、赤潮和海洋生物入侵等環境災害頻發,造成生態環境破壞和退化現象。建設海洋強國和推動海洋生態文明建設需要建立在海洋環境監測基礎之上;海洋環境監測是深刻認識和了解海洋的重要手段,直接影響著我國海洋環境保護和海洋資源可持續利用與發展。

　　為了滿足國家的需求,不斷豐富監測內容和創新監測方法。隨著分子生物學技術的迅速發展,基于生物基因的微觀監測方法在海洋環境監測中也有廣泛運用空間和利用價值。跟以往類似綜述文章相比,本文更加全面介紹了分子生物學技術在海洋環境監測中的運用,特別在污染物分析方面,作者結合本人研究成果概述了相關研究進展。因此,本文涉及的分子生物學技術主要有克隆文庫、變形梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrphoreses,DGGE)、環介導等溫擴增(Loopmediated isothermal amplification,LAMP)、實時定量PCR(Realtime quantitative PCR,q PCR)、限制性片段長度多態性(Restrictive fragment length polymorphism,RFLP)、核酸探針和基因芯片(Microarray)等技術方法,期望通過這些分子生物學技術為海洋環境監測的研究與發展提供借鑒。

　　2 浮游植物

　　在海洋浮游植物監測過程中,通過顯微鏡對其定量計數和鑒定是海洋監測的常規方法。顯微鏡觀察浮游植物會經常會遇到以下問題:(1)浮游植物鑒定需要有豐富分類經驗的專業工作者才能分析,使得很多實驗室不能開展這項工作;(2)有些浮游植物的形態非常相似,僅采用顯微鏡鑒定比較困難。例如,鏈狀亞歷山大藻和塔馬亞歷山大藻細胞形態就非常相似,僅在頂孔板形狀、后連接孔位置和腹孔等處有微小差異[2]。東海原甲藻和具齒原甲藻是否為同一種的爭論[3–4];(3)部分浮游植物為群體生活的種類,顯微鏡計數比較困難,例如擬菱形藻和棕囊藻。隨著對分離藻種鑒定的不斷深入研究發現,利用藻體中存在一些特異的功能基因可以分析浮游植物,如:核糖體基因(ribosomal DNA gene,r DNA)、核酮糖1,5—二磷酸羧化/氧化酶大亞基基因(rbc L基因)和貝類毒素基因(sxt基因)等。

　　核糖體基因中的18S、5.8S和28S r DNA基因具有結構功能保守和進化速度較慢的特點被廣泛作為區別不同屬浮游植物的一個分子指標;然而,核糖體基因中的內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)序列為選擇壓力小而變異速率快的高變區域,且其序列變化與進化距離相適應,具有保守區與高變區鑲嵌的特點,是區別同屬不同種浮游植物的一個很好分子指標[5]。因此,核糖體基因常作為鑒定浮游植物的一個有力證據。Bornet等[6]根據r DNA基因序列來鑒別形態學上不易識別的有毒多列偽菱形藻和無毒尖刺偽菱形藻。黃健等[7]利用ITS基因和5.8S r DNA基因對分離于青島膠州灣的兩株疑似亞歷山大藻進行準確鑒定。劉晨臨等[8]提出利用核糖體小亞基和ITS核酸序列標記的方法可作為鑒定我國海域的亞歷山大藻塔瑪復合種的常規手段。通過核糖體基因對浮游植物進行鑒定是一種可靠的分析方法,是鑒定和糾正物種分類等方面必不可少的分析內容。

　　研究浮游植物群落結構時,rbc L基因可作為顯微鏡常規鑒定的一種輔助手段。Li等[9]采用rbc L基因通過克隆文庫方法分析了北太平洋Subtropical Gyre中的浮游植物群落,發現該區域中的浮游植物主要為硅藻、甲藻、Pelagophytes和Prymnesiophytes,其中以硅藻最多。劉永健等[10]同樣采用rbc L基因分析了膠州灣表層海水中浮游植物群落,發現該區域中隱藻、定鞭藻和Stramenopies占優勢,而紅藻和綠藻所占比例較少。

　　赤潮藻是海洋環境監測中重點關注內容之一,特別是一些能產生毒素的藻類。貝類毒素(saxitoxins,STX)是一種主要由Alexandrium spp.,Pyrodinium bahamense和Gymnodinium catenatum產生的毒素。研究者最近發現sxt A基因是參與浮游植物合成STX的關鍵基因。Murray等[11]根據浮游植物中sxt基因建立了q PCR方法,并運用于環境樣品中Alexandrium catenella的監測。根據sxt A基因來分析赤潮藻是一種便捷分析方法。q PCR技術具有極高的靈敏性、特異性和快速性,在赤潮藻檢測中獲得了廣泛應用。表1總結了國內最近利用該技術運用于海洋環境中赤潮藻監測。國外關于赤潮藻的q PCR監測報道則相對較多,已成功用于幾十種赤潮藻的監測,如甲藻、定鞭藻、Pelagophyceae和硅藻等[12]。浮游植物的q PCR監測方面的應用尚處于起步階段,主要大批量分析樣品時具有一定局限性,q PCR技術需要制備高質量的DNA樣品,而很多浮游生物的DNA純化效率低,有時甚至根本就無法進行純化[5]。

　　3 海洋病原微生物

　　海洋環境中存在多種對海洋生物及人體健康具有危害的病原微生物。目前已經確定能嚴重危害人和海水養殖動物的重要致病微生物主要包括細菌、病毒和寄生蟲,但破壞海洋生態系統和對海洋環境污染做出響應的細菌主要是弧菌[19–20]。鑒于目前已發現的可培養微生物占到總微生物種類數的比例較小,以及病毒需要依賴于宿主生物的特點,本部分主要介紹分子生物學技術在海洋弧菌和病毒監測中的運用。

　　3.1 弧菌

　　弧菌是一類革蘭氏陰性桿菌幾乎來源于海洋環境。海洋弧菌已從20年前Vibrio和Photobacterium兩屬所含的20余種,增加為目前Enterovibrio,Grimontia,Photobacterium,Salinovibrio和Vibrio五屬所含共約80種[21–22]。弧菌也被證實是海水魚、蝦、貝類和人體的常見致病菌。已知可能感染魚或人類,并造成病害的海洋弧菌大約有20種,其中可能引起人類疾病的有12種。其中,又以Vibrio cholerae(霍亂弧菌),Vibrio parahaemolyticus(副溶血弧菌)和Vibrio vulnificus(創傷弧菌)最為重要,該3類弧菌對人體有很強的致病性[21,23–24]。目前國內關于弧菌的海洋監測方法通常是將樣品中能生長在固體選擇性培養基-硫代硫酸鈉檸檬酸膽鹽蔗糖培養基(TCBS培養基)上的菌群數等同于弧菌數。這種方法目前被認為不太科學,一方面原因是不僅弧菌還有其他的一些細菌類群如:發光桿菌屬、希瓦氏屬、屈撓桿菌屬、假單胞菌屬等都可在TCBS培養基中生長,TCBS培養基并不是特異性非常強的弧菌選擇性培養基[25];另一方面原因是寡營養條件下很多的弧菌處于活的但不可培養狀態,因此通過傳統的分離培養方法是監測不到這類弧菌[22]。然而,分子生物學技術可以避免上述的問題。

　　根據16S r RNA基因設計弧菌的特異性引物可以直接分析海洋環境中弧菌的微生物群落。Eiler和Bertilsson[22]根據弧菌16S r RNA基因采用DGGE方法分析了波羅的海和斯卡格拉克海峽水體中的弧菌,發現兩地的弧菌類群大約為2到6大類,且兩地的弧菌群落組成明顯不同。霍穎異等[23]則通過克隆文庫的方法分析發現舟山遠洋船舶壓載水中存在多種對人和動植物有害的病原弧菌(副溶血性弧菌和費氏弧菌)。孫穎[26]設計了3對擴增弧菌16S r RNA基因的引物,且發現引物(VF27和VR744)對海洋弧菌具有高度特異性能恰當的覆蓋海洋弧菌各類群。該對引物是擴增海水中弧菌16S r RNA的較理想引物;并利用這對引物分析發現膠州灣表層水體中存在多種弧菌,以類燦爛弧菌菌群為優勢類群。盡管在上述研究基于16S r RNA基因進行弧菌PCR擴增時存在部分非特異性的擴增產物,這是由于弧菌內16S r RNA基因序列高度相似,并且該基因的PCR擴增產物長度有限,從而通過該基因很難細致區分弧菌中成員。

　　弧菌在進化過程中不斷從外界獲得有利于在宿主體內定居與繁殖的遺傳因子,從而發展成具有毒力基因或者相關基因的毒力株或致病株[27]。現在已知的弧菌毒力基因種類繁多,并且不同的致病弧菌所攜帶的毒力基因會有所差別。因此,根據這些毒力基因的定性和定量監測就可以了解海水養殖和海洋環境海產品中所含致病弧菌的群落組成。前面介紹對人體致病性最強的為霍亂弧菌、副溶血弧菌和創傷弧菌,表2列舉了分子生物學技術針對以上三類弧菌毒力基因在海洋環境和海產品安全方面的運用。從表3中可以看出副溶血弧菌最主要的毒力基因為耐熱直接溶血素基因(tdh基因)和相對耐熱直接溶血素基因(trh基因);霍亂腸毒素基因(ctx基因)則是霍亂弧菌主要的毒力基因;創傷弧菌盡管目前的致病機制不是很清楚,但研究者認為溶血素基因(vvh基因)是創傷弧菌的重要毒力基因。毒力基因而且可以在種間和株間進行水平轉移,有研究發現通過船舶的壓艙水與水產品的進出口等多種途徑很容易造成毒力基因的地域性轉移,從而可能使當地某些無毒株轉變為有毒株[27]。因此,在海洋環境監測過程中,可通過分子生物學技術全面掌握病原性弧菌的毒力基因在重要海洋敏感區的分布狀況。

　　3.2 病毒

　　病毒被認為是海洋水體中數量最多的生物體,豐度高達1010L-1,是原核生物(細菌和古菌)豐度的5—25倍;病毒生物量則僅次于原核生物為第二大生物量組分;但是,由病毒引起的海水養殖生物的病害常有報道[36–37]。分子生物學技術可以利用病毒基因組序列,從分子水平上反映海洋環境中浮游病毒、人類傳染病病毒和海水養殖生物的病害病毒的群落組成以其動態變化。

　　分析浮游病毒的分子生態分布時,高惡斌和王子乾[38]認為病毒的結構蛋白基因g20、DNA聚合酶基因和輔助代謝基因等序列是合適于浮游病毒檢測分析的標記基因,可應用于浮游病毒多樣性監測。Clerissi等[39]就利用DNA聚合酶基因采用宏基因組結合第二代454測序方法探討了地中海Prasinovirus的時空分布。對于海洋環境中的人類傳染病病毒,明紅霞等[40]采用細胞培養結合q PCR方法監測了天津近岸海域4個季節中表層海水腸道病毒,發現夏季和秋季腸道病毒濃度較高,其次為秋季和冬季;基因序列分析發現該海域腸道病毒主要是脊髓灰質炎I型疫苗株。樊景鳳[20]建立了檢測甲肝病毒的“RT-PCR擴增-聚丙烯酞胺凝膠電泳-銀染色方法”,并將該方法檢測遼東灣海域海水和貝類體內甲肝病毒的分布。對于海水養殖區,更多關注的是魚類病害病毒檢測方法的建立,如:核酸探針技術、LAMP技術和RT-q PCR技術等[41–43]。

　　4 海洋入侵生物

　　外來海洋物種入侵已成為繼海洋棲息地破壞之后世界海洋生態環境面臨的第二個重大威脅。我國對于海洋生物入侵的研究還較薄弱,目前主要研究探討的是一些已建立種群的入侵種分布、入侵途徑和相關的防治措施介紹[44]。外來生物入侵包括引入、逃逸、種群建立和危害四個階段,而且每相鄰兩階段約有10%的物種可以成功存活[45–46]。生物入侵種在引入的初期可能都經歷一個較難檢測時期,一般手段根本無法對其進行檢測;而經過那段較長的潛伏期后,當入侵種被發現后已具有相當規模,并且很難再控制消除[45–46]。因此,防止生物入侵擴散的關鍵在于引入和逃逸兩階段的防控。海洋生物早期發育階段的卵和浮游幼體形態變化迅速并且種間形態差異較小。在早期采用傳統形態學分析很難發現入侵生物,而基于生物DNA序列差異的生物技術在監測早期的生物入侵時具有很好優勢[47–48]。Darling和Blum[47]提出根據監測樣品的復雜性、監測目標的專一性和監測生物是否需要定量這三個要求,可以選擇不同的分子生物學技術方法。確定海洋環境中是否存在已知特定的生物入侵種時,設計專門針對這一物種的引物進行PCR就能達到目標[47,49]。Harvey等[50]根據Heteroconchia,Pteriomorpha,Eumalacostraca,Pleocyemata和Ascidiacea各自r DNA基因間隔區序列的差異,然后設計特異性引物分析Puget Sound中本地種和入侵種的分布。監測低豐度的浮游生物幼體時,q PCR方法是種有效方法[48]。Smith等[51]根據18S r DNA基因序列采用q PCR方法監測了新西蘭Tasman灣中亞洲蛤的生物入侵情況,發現在10 g沉積物中就能檢測到1個浮游幼體,而在水體中沒有發現該物種。監測復雜樣品中入侵生物多樣性時,基因芯片技術運用較多,但是該類方法目前主要運用于微生物的監測[47]。我國對于入侵生物的早期監測研究缺乏,有效開展生物入侵監測技術為控制有害外來種具有重要意義。

　　5 其他海洋生物

　　傳統形態學性狀的多樣性實際上是生物分子性狀多樣性的反映,兩者之間的關系是表型與基因型之間的關系。前面介紹了分子生物學技術在鑒定浮游植物、微生物和入侵生物中的運用。該技術而且能用于浮游動物、魚類和珊瑚等的起源、分類與系統進化關系等研究。編碼線粒體細胞色素C氧化酶第一亞基的mt COI基因作為DNA條形碼成功用于橈足類、磷蝦類、介型類、端足類、毛顎類、枝角類、浮游軟體動物、刺胞動物和櫛水母等類群的快速鑒定[52]。DNA條形碼是使用標準化的DNA標記進行物種準確鑒定的技術,像商品的條形碼一樣建立DNA標記與物種信息之間的一一對應關系[53]。DNA條形碼(mt COI基因)也有成功分析南極海域浮游動物[54]和南海海域金線魚[55]的系統進化關系。Li等[56]根據mt COI基因、16S r RNA以及形態學特征區別了了織紋螺科中幾種螺的進化關系。劉麗等[57]則利用mt COI基因、16S r RNA和mt SSU三種基因對廣東徐聞地區常見的6科10屬17種石珊瑚的21個樣本進行分子系統學分析。在魚類的分子鑒定過程中,細胞色素b基因也常用于鯛[58]和石斑魚[59]等的系統進化關系分析。李淵等[60]根據葉綠體的mat K、rbc L和核糖體ITS基因采用PCR分析方法對采自愛爾蘭、日本、韓國和中國的4種海草(大葉藻、矮大葉藻、叢生大葉藻和紅須根蝦形藻)進行親緣關系比較。

　　6 污染物

　　隨著我國對海洋資源的開發利用和沿海各省經濟的快速發展,多種污染物通過自然作用(塵降、地表徑流、降雨)、生物以及人類開發等途徑進入到海洋,使得海洋成為各類污染物的最終“匯”集地。快速監測海洋污染物并對其毒性進行科學評價,成為當今環境科學關心的熱點問題[61]。海洋污染物對生物體的作用最早必然從個體的分子水平開始,然后逐步在細胞、器官、個體、種群、群落和生態系統各個水平上反映出來[62]。因此,由基因表達的酶活性異常能夠反映污染物早期毒性作用的生物分子標記物在海洋環境監測中具有很大的應用價值。

　　目前國內關于生物分子標記物研究主要集中在實驗室內單一污染物脅迫下受試生物體中生物標記物的篩選。已有研究最多的污染物為重金屬和石油類兩大類,而與之相對應的特異性生物標記物基因常為金屬硫蛋白基因(重金屬)和細胞色素P450基因(石油類)[61,63–64]。除此之外,重金屬脅迫下海洋雙殼類動物體中的熱激蛋白基因和抗氧化防御系統基因也有用于生物標記物監測的可能[64]。例如,劉慧慧等[65]利用q PCR技術研究了銅和鎘脅迫后谷胱甘肽S轉移酶基因(GST)在厚殼貽貝血液中的表達水平,指出厚殼貽貝GST基因可作為海水養殖環境污染監測的生物指示基因。以此同時,關于環境激素污染下卵黃蛋白原基因和有機磷污染下乙酰膽堿酯酶基因用于海洋環境污染指示的研究也有報道[61]。在生物分子標記物篩選中還需考慮不同分子生物學技術對研究結果的影響。莫正平等[62]利用LAMP技術和q PCR技術分別檢測了原油WSF暴露褐菖鲉1 d后HSC70基因的表達水平,結果q PCR技術的靈敏度更高。因此,生物分子標記物研究需考慮污染物脅迫下時間-效應和劑量-效應的敏感性和特異性問題。

　　通過實驗室對生物分子標記物的初步篩選后,將其運用于野外環境中污染物的預警與評估將是今后研究重點。該類研究在國內海洋環境中運用相對較少。安立會等[66]采用q PCR方法分析發現渤海南戴河野生梭魚金屬硫蛋白基因(Metallothionein,MT)的表達水平明顯高于大神堂野生梭魚的表達水平;同時,南戴河中該類魚體的重金屬殘留水平要高于大神堂;因而認為梭魚MT基因是監測海洋重金屬污染的一類生物標志物。目前野外環境中的受試生物一般選擇魚類作為模式生物,主要由于魚類處在海洋環境中較高的食物鏈端;而海洋環境中其他的一些鳥類、兩棲類和海洋哺乳類的遺傳特性和污染物毒性機制不太清楚,使得它們作為模式生物具有一定的局限性[67]。國外針對自然環境中污染物采用生物分子標記物的評價方法也主要是關于重金屬和多環芳烴類的監測,例如:南極洲Trematomus bernacchii體內CYP1A基因作為指示環境中PAHs污染[68],以及地中海海岸Lithognathus mormyrus體內MT基因作為指示Cd污染的生物標志物[69]等。

　　目前有研究發現基于微生物功能基因的檢測也能反映出海洋環境中污染物狀況。作者采用克隆文庫方法發現珠江口中具有PAH羥化雙加氧酶(PAH-RHD)基因的微生物多樣性與環境中PAHs污染水平具有正相關性,PAH—RHD可以做為PAHs污染的生物標志物[70]。很多研究通過q PCR方法同樣發現這一規律,表現為環境中PAHs污染水平越高,微生物PAH-RHD基因拷貝數越高[71]。以此同時,有研究發現自然環境中微生物的抗生素抗性基因與環境中的抗生素含量也具有正相關性。Chen等[72]采用q PCR方法定量分析珠江口沉積物和水體中微生物tec基因豐度,并發現tec基因豐度與抗生素具有很好的相關性(相關性均大于0.73),而且沉積物中該相關性要高于水體;另外,夏季和冬季的季節變化對這一相關性影響不大。梁惜梅等[73]分析珠江口5個水產養殖區沉積物中抗生素總含量(磺胺類、喹諾酮類和四環素類抗生素之和)與微生物中相應污染物抗性基因豐度之間也存在顯著的正相關性(P<0.05);此外,微生物體中的整合子(int1基因)豐度也能指示珠江口養殖區中抗生素污染。

　　生物標志物在海洋環境監測中的應用仍處于起步階段,有關研究結果大多是定性描述,而沒有達到定量的研究水平。基于這個層次的分析,可以將生物標志物加入到生態系統健康評價中,這將是一項非常有意義的研究工作。在污染物對海洋生態系統潛在危害的評估和預測過程中,可以考慮選擇表征不同種類污染物的生物標志物加入到評價體系中。以往國內對生態系統的評價主要從兩方面考慮,一方面直接測定水質、沉積物或生物體中的各種污染物含量;另一方面通過調查該區域的海洋生物種類和數量的變化。原來的這種評價方法往往不能直接反映污染物對生物體或生物群落產生的直接影響作用。因此,基于生物標志物的監測方法在今后海洋生態系統的健康評價中將發揮重要作用。

　　7 展望

　　盡管目前有研究表明分子生物學技術能用于海洋環境監測,并且有其自身的優越性也有部分成功的例子,但是要廣泛采用分子技術用于環境監測仍有一段距離。首先,分子生物學分析方法還是需要人工去野外進行采樣然后帶回實驗室進行樣品分析,這個過程需要花費幾小時到幾天的時間。對于一些海洋突發事件,最理想的監測是能實時了解事件發展狀況,比如:赤潮預報就需清楚浮游植物的種群動態變化。但是目前沒有能在野外現場進行實時分析的分子生物學技術。其次,PCR技術還有其自身需要克服的關鍵問題。高質量模板的獲取非常重要,任何分子生物學技術研究前提都需要高質量和高含量的DNA或RNA樣品。如果提取樣品模板質量和含量較差,采用最先進的分子技術手段也無法獲得滿意結果,提取模板應該盡量減少抑制PCR擴增的物質含量。另外,合適的引物能減少PCR過程帶來的假陽性產物;在PCR過程中也需防止對優勢種群的放大效應,從而減少對低微物種數量的掩蓋問題產生。因此,PCR實驗過程也是影響分子生物學技術在環境監測運用的一個重要問題。再者,隨著對監測能力提高的要求,需要采取的監測方法能滿足簡單而高效的特點。然而,相對于簡便的傳統顯微鏡檢等方法,目前很多的分子技術手段花費的經費較高。隨著測序技術、基因芯片和生物信息學等的發展,分子生物學技術將在實用和高效等方面將有突破。另外,任何一種分子生物學技術都存在一定的局限性,也不可能解決所有問題。這就要求多學科交叉,將分子生物技術和化學分析、形態學分析和統計學等方法結合,然后綜合運用到海洋環境監測中,才能最終闡明海洋生態問題為保護海洋提供技術支撐。

　　參考文獻
　　[1]王自強.海洋經濟監測預警模型研究[D].青島:中國海洋大學,2010.
　　[2]陳月琴,屈良鵠,曾隴酶,等.南海赤潮有毒甲藻鏈狀-塔瑪亞歷山大藻的分子鑒定[J].海洋學報,1999,21(3):106–111.
　　[3]陸斗定,齊雨藻,GOEBEL J,等.東海原甲藻修訂及相關原甲藻的分類學比較[J].應用生態學報,2003,14(7):1060–1064.
　　[4]羅立明,胡鴻鈞,李夜光,等.東海原甲藻的分子鑒定[J].海洋學報,2006,28(1):127–131.
　　[5]于志剛,米鐵柱,姚鵬,等.赤潮藻鑒定與定量檢測方法進展[J].中國海洋大學學報,2009,39(5):1067–1076.