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      植物學研究中染色體分選技術的運用

      來源:原創論文網 添加時間:2021-03-20

        摘    要: 介紹了染色體分選技術的基本原理和樣品處理的基本流程,對根尖分生區采用同步化處理,制備染色體懸浮液,最后通過流式細胞儀的分析與收集獲得純度高、數量多的目標染色體。綜述了染色體分選技術在植物學研究中的主要應用,包括物理圖譜的構建、DNA分子標記的開發、以及復雜多倍體植物的基因組測序等。通過染色體分選技術的不斷完善與發展, 應用于染色體分選的探針標記不斷開發,以及分選后的染色體DNA純化和擴增技術的優化,將為多倍體植物如甘蔗等基因組學研究提供更有效的幫助。

        關鍵詞: 染色體分選; 流式細胞術; 基因組; 多倍體植物;

        Abstract: The basic principle of chromosome sorting technology and the basic process of sample treatment were introduced. The chromosome suspension was prepared by synchronizing the apical meristem. And then the target chromosomes with high purity and high quantity were obtained by flow cytometry. The main applications of chromosome sorting technology in plants were reviewed, including the construction of physical maps, the development of DNA molecular markers, and genome sequence of the complex polyploid plant. With the continuous improvement and development of chromosome sorting technology, the development of probe markers for chromosome sorting and the optimization of chromosome DNA purification and amplification technology after sorted, it will provide more effective help for the genomics research of polyploid plants such as sugarcane.

        Keyword: Chromosome sorted; Flow cytometry; Genome; Polyploid plant;

        染色體分選技術是一種基于流式細胞儀在經細胞周期同步化富集中期染色體的懸浮液中快速分析、分選染色體的有效手段[1]。起初,在人類基因組計劃方面研究比較多[2],在植物方面研究很少。隨著高質量的植物染色體懸浮液的成功制備,植物染色體分選技術的研究獲得了快速發展[3]。國外在染色體分選方面的研究報道較多,特別是捷克、美國、澳大利亞等國家, 而國內鮮有報道。國際小麥基因組測序聯盟(International Wheat Genome Sequencing Consortium, IWGSC)提出將小麥基因組分離為染色體或染色體臂組成,并構建相應的BAC文庫[4]。后續BAC測序和物理圖譜的構建由IWGSC成員國分擔,我國主要是負責7DL物理圖譜構建。通過這種“化整為零”的方法,IWGSC完成了小麥染色體的物理作圖,并使基因組測序得以完成[5]。受此鼓舞,染色體分選技術在復雜基因組植物中的應用越來越廣泛。通過對基因組中各條染色體的分選來完成全基因組的測序,不僅解決了組裝困難的問題,而且可以進一步研究基因組的結構和進化,并且可以分離出感興趣的一條或多條染色體進行精細研究。染色體的分離使得我們可以用感興趣的基因分析染色體,例如,由于小麥基因組的高度復雜性和多倍體性阻礙了基因定位的克隆和靶標記的開發。通過對分選得到的小麥7A、7B和7D染色體的精細研究,最終從小麥染色體臂7DS上成功克隆了俄羅斯小麥抗蚜蟲基因Dn2401并開發出11個新的與基因相關的標記[6]。自然界中高等植物的多倍化現象較為普遍,對其全基因組測序和組裝還存在困難,因此采用染色體分選技術是一種不錯的選擇。
       

      植物學研究中染色體分選技術的運用
       

        流式細胞術(flow cytometry, FCM)作為分子生物學應用最廣、最普遍的細胞定量分析技術, 具有精確、高效的優點,是根據液體懸浮液細胞或其他生物大分子的理化性質與光學參數進行功能水平上的精確收集與分析,從而實現對目標顆粒群體進行快速、準確的分析和分選[7]。早期流式細胞術在植物染色體分選中采用的是單色標記,即只用一種熒光標記物標記懸浮液中的染色體,這樣染色體的大小可用熒光信號值的強弱來表示,這種熒光信號最終在計算機上表現為數值的大小,形態大小相近的染色體聚集在一起就形成峰或點,不同的染色體因自身的長短、形態而聚集成不同的峰或點,從而達到分選染色體的目的。但是這種分選方式要求被分選的植物染色體形態必須差異大,然而,大多數植物的染色體間形態往往差異沒那么大,因此采用單色標記法常常難以分選到感興趣的染色體。使染色體分選技術得到迅速發展的原因是懸浮液熒光原位雜交技術與染色體分選的結合。研究人員通過設計探針,給目標染色體標記熒光信號,從而能夠分選感興趣的染色體進行研究。這種利用雙色標記進行流式核型分析的方法在植物染色體分析中發揮了強大的優勢,對完成小麥基因組測序工作發揮重要作用[5]。目前,流式細胞術在植物染色體上的應用不僅體現在流式核型分析方面,也表現在目標染色體物理圖譜的構建、遺傳學標記的開發以及染色體測序等相關研究。

        1、 流式細胞術染色體分選的基本原理

        流式細胞術是根據細胞理化性質,對懸浮液中的細胞群體進行快速、準確地分析與分選。早期其主要應用于動物細胞研究,而在植物細胞學研究的應用較晚,原因是植物細胞結構與動物細胞不同, 具有細胞壁和特殊的細胞器,制備單細胞懸浮液比較困難。流式細胞術廣泛應用于DNA含量、檢測細胞凋亡、植物細胞周期、染色體核型和流式分子表型分析等方面研究分析[8,9]。流式細胞術分選染色體的基本原理是把經細胞周期同步化后的根尖組織進行酶解或進行機械勻漿,制成染色體懸浮液,在其中加入熒光標記探針與靶染色體進行雜交,制成熒光染色體懸浮液。然后,將其加入到流式細胞儀中,在鞘液帶動下高速通過光學檢測系統,流式細胞儀中熒光信號的相對強度表現為染色體的含量。通過流式細胞儀可以將熒光標記的染色體信息可視化地表現在電腦上,結果可以用染色體分布的一維直方圖或二維散點圖表示(分別是柱狀圖或散點圖)。在一維直方圖中,不同的染色體在分布范圍內形成不一樣的峰值,每種峰值都代表一種染色體大小的差異;而在二維散點圖中,不同的染色體形成不同的簇。通過染色體DNA含量和堿基對特異性熒光色素檢測到的A-T/G-C含量差異將其分開。然后,通過調節分選參數,流式細胞儀可以自動對不同染色體峰或形成的簇進行分類,收集分選出的單一類型染色體。

        2 、染色體分選樣品的處理

        染色體分選技術包括細胞同步化處理,染色體懸浮液制備以及利用流式細胞儀對分選染色體的流式核型分析、分選和收集,最后得到分選出的染色體。

        2.1 、制備植物染色體的材料選取

        植物細胞周期同步化的材料主要來源于葉肉原生質體或根尖分生組織的懸浮培養細胞。細胞懸浮培養具有生長迅速、便于處理等優點,已在胡蘿卜(Daucus carota)、煙草(Nicotiana tabacum)、小麥(Triticum aestivum)等植物的懸浮細胞培養中成功進行同步化誘導。1984年De Laat等[10]以同步化誘導后的纖細單冠菊(Haplopappus gracilis)的懸浮培養細胞為材料,完成了植物染色體的首次流式核型分析。但是懸浮液培養細胞存在缺點,即建立一個懸浮培養體系耗時多,需要數月甚至數年時間,并且核型的穩定性差,不利于遺傳研究與利用。因此研究人員嘗試通過培養植物葉肉原生質體來獲得染色體,1987年Conia等[11]以矮牽牛(Petunia hybrid)的葉肉原生質體進行同步化誘導,但是這種方法富集的中期指數只有10%。并且由于植物葉肉原生質體難獲得,培養體系難構建,葉肉原生質體方法并沒有得到廣泛的運用。1992年Dolezel等[3]成功利用蠶豆(Vicia faba)的根尖分生組織制備了高質量的染色體懸浮液。Halfmann等的研究表明,生長活躍的植物根尖分生組織中細胞群體分裂旺盛,并保持恒定的循環周期,易于進行人為同步化調控處理[12]。由于植物根尖具有來源廣、易處理、可重復以及穩定性高等優點,通過使用植物根尖材料實現了多種植物的中期染色體富集的研究,如小麥[13]、豌豆(Pisum sativum)[14]、棉花(Gossypium hirsutum)[12]和甘蔗(Saccharum officinarum)[15]等。

        2.2、 細胞周期同步化富集中期染色體

        根尖是制備染色體懸浮液,實現染色體分選的理想材料。然而,未經處理的植物根尖材料用于制備染色體懸浮液的效果并不理想。在自然條件下生長的根尖分生組織細胞中,處于分裂期的細胞僅占整個分生區細胞的5%~8%[16],用其制備的染色體懸浮液中包含大量細胞核以及細胞雜質。在進行染色體分選時,過多的核以及雜質會干擾染色體的識別,導致分選效率低下、誤差大。因此,在進行染色體懸浮液的制備前,首先進行細胞周期同步化處理,即通過低溫、DNA合成抑制劑和微管抑制劑等理化措施對根尖分生組織細胞進行處理,使其大部分細胞處于有絲分裂的中期,從而獲得以中期染色體為主的流式核型[17]。

        植物組織中細胞周期同步化誘導主要有兩種策略:即物理法與化學法誘導。物理法是根據細胞的物理特征將細胞同步化,常用的有離心淘析法(centrifugal elutriation),即利用細胞在不同時期的大小不相同的特點,通過離心方式對目標階段的細胞進行分離與收集,以獲得同步化的群體[18]。雖然這種方法操作簡單,但是需要的實驗設備特殊且昂貴,因此應用并不廣泛。化學法則在細胞的不同階段采用不同類型的化學抑制劑處理,以達到對特定細胞周期的關鍵響應因子進行功能抑制,使細胞分裂過程受阻停滯在某一階段,從而達到富集某一目標時期的細胞群體的目的。在去除抑制后,細胞會繼續向下一個階段前進。通常采用不同類型的化學抑制劑對細胞生長周期進行人為調控,主要分為兩種,一種是DNA合成抑制劑,通過抑制周期蛋白(cyclins)和細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclins depen- dent kinases, CDKs)的有效表達,使細胞暫時抑制DNA的復制,停留在G1/S階段,如羥基脲(HU)、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷等均可以抑制DNA的合成,去除DNA合成抑制劑后細胞可恢復正常進程。第二種是微管抑制劑,通過破壞有絲分裂中微管的形成,消除紡錘體的牽引力從而將細胞阻斷在中期,達到富集中期染色體的目的,如甲基胺草磷(amiprophos-methyl, APM)、氟樂靈(trifluralin)以及秋水仙堿(colchicine)等。由于不同植物的生長周期不同,為達到理想效果,對細胞的同步化處理也應調整優化。而為了提高細胞周期同步化效率,通常會將兩種類型的抑制劑組合使用。早在1999年,Dolezel等[13]就通過對HU和APM進行組合,對蠶豆根尖進行同步化處理,獲得的中期指數最高可達70%。在大麥(Hordeum vulgare)根尖細胞周期同步化中,Lee等[16]通過組合使用HU與氟樂靈,獲得的染色體中期指數高達76.5%。

        2.3、 染色體懸浮液的制備

        受染色體懸浮液制備質量的限制,植物染色體分選研究進展緩慢。高等植物細胞具有細胞壁,細胞壁對染色體的分離造成了一定的困難。要獲得完整的染色體,必須先去除細胞壁的束縛。有兩種方法從植物體細胞中釋放染色體:一種是酶解法,通過混合酶液(纖維素酶與果膠酶等)的酶解處理,可以去除細胞壁,但這種方法操作過程繁瑣,而且酶解后產生的大量細胞碎片不利于直接進行流式分析[10];第二種是機械破碎法,也是現在主流的制備染色體懸浮液的方法。將同步化處理后的根尖細胞用甲醛溶液固定,用超高轉速破碎細胞壁使染色體釋放出來,然后用50 μm孔徑濾膜過濾細胞碎片。機械破碎法對染色體損傷小,且懸浮液中細胞碎片含量減少,可提高分選染色體的純度[3]。進一步的研究表明,對經機械破碎后的染色體懸浮液采用蔗糖梯度的方法進行純化,可以使染色體懸浮液中的細胞碎片及雜質含量更低,染色體形態結構更完整,背景更加清晰[19]。

        多種因素都會影響到制備的染色體懸浮液質量。其中,固定液種類和固定時間對染色體形態的影響都很大。因而有不少關于對甲醛固定液濃度和固定時間進行優化的研究,以期獲得高質量的染色體懸浮液。如Lee等[20]對大麥根尖細胞同步化,在獲得76.5%的中期染色體指數基礎上,采用2%的甲醛固定20 min,機械勻漿后獲得了高質量的細胞懸浮液;同樣地,對所獲得的70%的中期染色體指數的玉米根尖用3%的甲醛固定25 min后機械勻漿,也獲得高質量的懸浮液[21],為后續研究奠定了基礎。染色體懸浮液的裂解緩沖液的選擇也很重要, 裂解緩沖液影響染色體的形態穩定性,用裂解緩沖液可以使懸浮液中的染色體處于獨立穩定的形態而不聚集和沉淀,利于分選染色體。常用的裂解液有LB01、MgSO4、WPB、Otto’s等[22],不同植物適用的裂解液也可能不同。因為染色體懸浮液的質量對染色體分選至關重要,因此在對一種植物進行染色體分選前,對甲醛固定液的濃度、固定時間和裂解緩沖液進行優化篩選很有必要。

        3、 染色體分選技術在植物學研究中的應用

        雙色熒光信號標記的應用使染色體分選技術得到進一步發展,分子標記與目標染色體結合可以幫助研究者實現分選目標染色體的愿望。由于它能夠按照研究人員意愿分離到數量較多的純度極高的特定染色體而得到廣泛應用。所分選的高純度染色體或片段極大地簡化了植物復雜基因組的分析, 并為物理圖譜構建、遺傳學標記開發以及基因定位等方面的研究提供幫助。而基于染色體技術進行基因組學的研究分析被稱為染色體基因組學。流式分選染色體的主要用途隨著細胞學、分子生物學和基因組學方法的發展而不斷擴大。

        3.1、 構建物理圖譜

        基于流式細胞儀的染色體分選技術可以分選出目標的染色體,用來構建染色體的BAC文庫[23]。被流式細胞術分選出來的染色體本身就包含基因組的部分獨立的DNA序列,因此研究者可以將分選出的染色體作為模板來定位基因或遺傳標記在染色體中的位置,從而構建分選染色體的物理圖譜和遺傳圖譜。通過這種方法研究者已將球蛋白基因繪制到豌豆的基因圖譜上[24]。之前,由于等位基因的缺失變異,這些基因難以繪制到基因圖譜中。利用分選出的在蠶豆和豌豆中相互易位的染色體, Macas[24]和Neumann[25]將大量DNA序列定位到它們的亞染色體區域。Simkova[26]用分選出的面包小麥的7D染色體分別構建了7DL和7DS染色體的BAC文庫。對于7DS文庫,利用俄羅斯小麥蚜蟲抗性基因DnCI2401相關的標記物篩選,獲得包含抗性基因DnCI2401的克隆片段;而7DL文庫采用與綠盲蝽抗性基因Gb3相關的探針雜交篩選,獲得包含Gb3的克隆片段。由于分選得到的面包小麥7D染色體的克隆相對于基因組的克隆數目少,所以篩選效率高,成本低。Zatloukalová等[27]對流式細胞術分選出的鷹嘴豆(Cicer arietinum)染色體進行染色體核型研究,最終將物理圖譜與遺傳圖譜整合,并開發出一套有效的細胞遺傳標記物,其中2個分子標記可以鑒別染色體E和H。Roberto等[28]利用染色體形態差異并結合5s與45s在染色體中的定位對蘆筍進行染色體分選,發現有4種染色體(IV、V、VI和VIII)可以被區分和分選;然后,利用72個SSR標記對流式核型上單個峰的染色體含量進行了鑒定,其中27個被納入遺傳連鎖圖譜,并將遺傳連鎖群聯系到染色體上,同時發現性別決定位點位于LG5上,其與V峰相關,V峰代表了一個帶有5S rDNA位點的染色體。

        3.2、 DNA標記的開發

        通過分選出單個染色體可以降低模板的復雜性,有利于遺傳標記的開發。標記是構建遺傳連鎖圖譜、基因定位、組裝物理圖譜以及圖位克隆的重要資源。在植物遺傳學中應用最廣泛的標記是SSRs、DArTs (多樣性微陣列技術)、ISBPs (基于插入位點的多態性)和SNPs (單核苷酸多態性)。通過分選染色體構建染色體的特異文庫,開發DNA分子標記是一種有效的途徑。DNA標記既可從短插入染色體特異文庫中獲得[29],也可以從長插入染色體特異文庫中獲得[30]。DArTs標記的開發不需要構建染色體特異文庫,可直接從分選染色體純化后的DNA中開發得到。Wenzl等[31]從分選的小麥3B染色體和1B染色體短臂分別獲得了510和59個DArTs標記,而該方法的效率明顯大幅提高,只篩選了2 688個小麥3B染色體的克隆就獲得了510個標記,然而篩選整個基因組大約70 000個克隆才獲得了269個標記。利用染色體分選技術與測序技術結合可以開發大量的染色體特異性標記,Shatalina等[32]利用分選出的2個六倍體冬小麥Arina和Forno的3B染色體測序開發出70多個SNPs標記。

        3.3、 基因組測序

        隨著測序技術的不斷發展,越來越多植物的基因組序列及組成被人們破解,為基因組學研究提供了基礎。然而對于一些基因組信息龐大、富含高度冗余序列的多倍體植物來說仍然存在測序和組裝困難以及測序成本高的問題。但是染色體分選技術的出現使得研究人員可以將植物體復雜的基因組拆分為染色體組,通過分選單條染色體或染色體臂進行深入研究,解決了多倍體植物測序和組裝困難的問題。國際小麥基因組測序聯盟為了測定小麥的全基因組序列,提出了染色體逐條測序的方法,利用流式分選技術對中國春小麥的21條染色體進行分離,并構建了相應的BAC文庫為基因組測序提供幫助。Jin等[33]利用流式細胞術對簇毛麥染色體4VS進行了分選,并利用Illumina平臺進行測序獲得大約170.6 Mb的組裝序列;該序列為小麥黃花葉病毒抗性基因Wss1的定位和圖位克隆提供了有價值的信息。Akpinar等[34]報道了利用流式分選染色體技術分選出野生二粒小麥的5B染色體,然后進行測序,通過研究蛋白編碼基因、重復元件和假定的microRNA和tRNA編碼序列,揭示其基因組的結構、組織和功能,助力小麥的遺傳改良。Miao等[35]對六倍體小麥‘CRNIL1A’的3B染色體進行分選并測序,報道中國春小麥3B染色體上缺失的CRNIL1A序列約為8.3 Mb,與中國春小麥基因組序列進行比對,大約有159.3 Mb的序列不存在于‘中國春’的基因組中。把來自不同地理起源的226份普通小麥的序列與‘CRNIL1A’特異序列進行比較,結果表明部分序列只存在于特定區域的小麥基因型中, 表明具有這些序列的品種分布存在地域差異性,可能與小麥的適應性選擇有一定關系。

        現代甘蔗栽培品種主要由熱帶種Saccharum officinarum和細莖野生種S. spontaneum雜交而來,為異源多倍體,染色體倍性變化大(可多達16倍以上),基因組組成復雜[36];目前對甘蔗栽培種基因組的研究較少,2018年Garsmeur等[37]用PacBio RS II測序平臺對甘蔗R570構建的BAC文庫進行一一測序,由此構建了只有基因富集區域序列的1個僅為370 Mb的簡單甘蔗基因組。2018年Zhang等[38]完成了對單倍體細莖野生種AP85-441 (4x=32)的全基因組測序,但更高倍性的原種和甘蔗雜交品種等染色體水平基因組序列尚難以完成。染色體分選技術可為甘蔗基因組研究提供一種有效手段,通過對甘蔗栽培種染色體逐條分選完成全基因組的測序,為甘蔗栽培種遺傳和物理圖譜的構建,遺傳育種的分子標記開發提供基礎。目前,有研究首次報道了利用流式細胞技術制備甘蔗完整染色體懸浮液的方法[39];并且通過對甘蔗的2熱帶種和3個雜交種材料進行流式核型分析,發現甘蔗熱帶種的峰圖比雜交種峰圖更突出,且具有更多分離的峰。研究結果表明這種差異可能與雜交種具有雙基因組結構有關。這種通過流式細胞術分選甘蔗染色體的方法將使我們能夠分離和分析目標染色體并對其進行測序,從而進一步研究甘蔗基因組的結構和進化。我們相信染色體分選作為一種不斷完善的技術在植物基因組學研究中將有更加廣闊的應用前景。

        4 、展望

        4.1 、染色體分選技術的開發與利用

        染色體分選技術在高等植物中主要是通過利用染色體之間的較大差異來分選染色體,即通過單色熒光直接標記染色體,根據熒光信號強度,對染色體形態差異明顯的峰值圖或聚集成簇的散點圖進行分選[40]。這種方法只能分選1條或幾條形態差異大的染色體,并不能按照研究人員的意圖分選染色體,并且分選出來的染色體會含有少量非目標染色體,影響研究結果。

        隨著染色體分選技術的發展,通過開發特異的分子標記結合懸浮液熒光原位雜交技術可以實現按照人們意圖選擇想要分選的染色體[41];這種雙色熒光采用兩種核酸染料分別對整條染色體和雜交探針位點進行標記,通過兩種不同熒光信號強度可以分選出任意帶有分子標記的染色體,且這種方法分選出來的染色體純度更高。然而,有效分子標記探針的缺乏阻礙了其進一步發展,目前常用的標記探針只有45S和5S[28],因此開發更多新的染色體特異的分子標記是提高染色體分選效率的關鍵。

        染色體分選技術雖然可以一次性收集幾萬到幾十萬條單一類型的染色體,但所含的DNA含量還是太少了,還達不到三代測序所需的5~10 ?g的數值含量,Capal等提供了一種可將分選出的染色體DNA經純化后擴增的方案,該方案拓展了染色體基因組學的潛力,并為染色體結構雜合性和植物單倍型定相研究開辟了新的途徑[42],但該方案仍存在擴增后的組裝序列片段小的問題。

        4.2 、染色體分選技術在基因組學研究中的作用

        基因組測序技術的應用為評估植物基因組組成提供幫助,并有助于將基因組學方法引入到植物改良項目中。基因組測序技術在小基因組物種和有參考基因組序列的植物中應用較為簡單。然而,對于一些沒有參考序列,基因組龐大、復雜的物種, 整個基因組的測序數據很難處理和使用。例如,普通小麥包含3個基因組(AA、BB、DD),基因組序列數據約為17 GB, 其中重復序列高達85%[43]。對于這樣復雜基因組物種來說,全基因組測序是難以完成的。因此,運用流式細胞術分選單條染色體或染色體臂為降低基因組的復雜性提供了一種有吸引力的方法。自然界中有很多植物和小麥一樣擁有復雜的基因組,對他們進行基因組學研究還存在困難,而染色體分選是通過分選出單條染色體逐條完成基因組測序,簡化了測序和組裝的過程。將染色體分選技術應用于同樣復雜的甘蔗基因組研究中也是一種可行的方案,可為甘蔗基因組測序和組裝提供新的技術支持。我們相信,隨著染色體懸浮液制備方法的優化,流式細胞術多參數分析和分選技術的開發,染色體分選技術在高等植物中的應用越來越廣,為高等植物的復雜基因組研究提供了另一種視野。

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